Tudo começa quando uma doença chamada de  The Blorbs  infecta os Toads fazendo-os ficarem inchados e rolando pelo Reino do Cogumelo afora. Tentando buscar uma solução a Princesa Peach convoca um reunião para tentar solucionar o problema, claro que ela chama  a dupla de encanadores italianos para ajudá-la. 

Mas antes que mais possa ser feito ou dito, a cena muda e é mostrado o Bowser sendo pego inconsciente e alimentado com o que ele acredita ser um "Lucky Mushroom". Isso na verdade, não é nada além de uma armadilha elaborada por Fawful (o inimigo dos Mario & Luigi anteriores) em um esforço para controlar o Rei dos Koopas. Fawful conseqüentemente manipula a fera gigante, fazendo-o ir ao castelo da Peach e sugar tudo e todos, incluindo os irmãos Mario. Assim a aventura começa, mostrando Bowser aparecendo em todo o esplendor na tela de cima, enquanto Mario & Luigi são banidos às partes internas do corpo de Bowser que é mostrado na touch-screen.

O sistema continua o mesmo dos jogos anteriores, com os personagens sob seu controle andando pelo mundo e desviando de inimigos, ou mesmo tentando pular neles para ganhar pontos de saúde extra antes da batalha começar. Assim que a batalha começa, Mario e Luigi se intercalam pulando na cabeça de um inimigo, batem neles com seus martelos, ou usam suas armas especiais (Power Ups como os Cascos Verdes e Fire Flowers). O diferencial nas lutas é que você pode sugar inimigos do mundo exterior para o estômago do Bowser para que Mario e Luigi possam acabar com eles.

Também temos novidades, como por exemplo quando o Bowser precisa comer uma cenoura gigante e o único modo de fazer a coisa descer pela sua garganta é fazendo com que Mario e Luigi o ajudem a digerir o mais rápido possível, utilizando a stylus  para quebrar o alimento em partes menores para que sejam digeridos, a mecânica funciona tão bem que nem é preciso quebrar a cabeça para perceber o que precisa fazer.

Como visto em alguns videos as vezes aparece um Bowser Gigante, isso foi algo que realmente elevou o RPG dos encanadores a um novo patamar, como citado acima, basicamente você terá que fazer com que Mario e Luigi acertem "bolas de energia" de cores vermelha e verde para que Bowser ganhe um super crescimento e assim lute contra o seu inimigo. nesse estilo de jogo você controlará Bowser com o Nintendo DS na vertical, em forma de "livro".

Com uma jogabilidade testada, fórmula clássica de outros Mario & Luigi, a mecânica de introduzir Bowser ao jogo tradicional, além de uma trilha sonora extremamente viciante e visuais bem detalhados, Mario & Luigi: Bowser's Inside Story com certeza entrará para a lista de um dos melhores jogos do gênero em 2009.